摘要
每年有近万人死于乙型肝炎病*（HBV）相关疾病。虽然可进行抗病*治疗，但由于肝脏中游离的病*共价闭合环状DNA（cccDNA）的持续存在，慢乙肝患者通常需要终身治疗且治愈率较低。目前对慢性乙型肝炎（CHB）中cccDNA池的了解是有限的。此文作者利用HBV较高的突变率，结合数学模型和已知的HBV进化速率，估计在HBeAg阳性感染期间，cccDNA寿命为61(36-)天，而在HBeAg阴性感染阶段仅为26(16-81)天。该模型为HBV池的动态变化提供了重要的见解，有助于未来设计和评估新的治疗方法。
慢性乙型肝炎(CHB)患者通常用核苷(酸)类似物(NAs)治疗，其作用机理是竞争性抑制pgRNA逆转录形成rcDNA的过程。然而，由于并不直接针对cccDNA池，NAs一旦停止治疗容易发生病*反弹。cccDNA半衰期可定义为肝脏中cccDNA拷贝数减半的时间，其取决于多种因素，包括cccDNA的“寿命”(单个cccDNA分子存活的时间)和通过细胞外病*感染或细胞内扩增（内补充）产生新的cccDNA(图1A)。然而，人类肝脏中cccDNA的寿命是未知的。作者提出HBV宿主内进化速率可以用来估计病*的cccDNA寿命和复制能力(细胞外病*产生和细胞内扩增的综合指标)，并利用已知的HBV突变率和进化率开发了一个新的数学模型来对其做出推断。
作者建立了一个与细胞感染率无关的数学模型来描述肝脏中cccDNA分子的数量，并解释了肝细胞有丝分裂期间细胞内外cccDNA的扩增和丢失(图1B)。利用这个模型，作者导出了病*扩增时间（generationtime）的表达式，定义为一个cccDNA分子在感染后的t时刻生成另一个cccDNA分子的时间g(t)和在该时间内的中性进化速率S(t)。在平衡状态下，作者证明了cccDNA的寿命LE等于病*扩增时间gE，gE为中性突变率与中性进化速率的比值（μ/SE）。表1给出了通篇使用的符号。
图1.乙肝病*生命周期、数学模型和预计的cccDNA寿命
表1.用于描述模型的符号
1.cccDNA的寿命
根据已知的HBV突变率和进化率，作者用公式推导了CHBHBeAg阳性（HBeAgPOS）和HBeAg阴性（HBeAgNEG）阶段cccDNA寿命的概率分布。在HBeAgPOS感染期间，当病*载量（VLs）高而稳定时，cccDNA预计寿命为61天(第5-95个百分位数为36-天；图2，橙色线)。相反，在HBeAgNEG感染期间，cccDNA寿命预计只有26天(16-81天；图2，蓝线)。
图2.乙型肝炎病*感染不同阶段cccDNA寿命的概率分布
cccDNA在HBeAgNEG期的寿命比HBeAgPOS期短，可以用较高的cccDNA清除率来解释。由于cccDNA分子的清除率较高，也由于cccDNA的复制能力b降低，HBeAgNEG感染过程中宿主免疫应答的增强可能使cccDNA的基本复制数R0低于1。当R01时，cccDNA的数量会持续下降。在这种非平衡情况下，cccDNA的寿命可能比推测的26天短，因为病*的扩增时间将大于cccDNA的寿命(图3)。
作者的模型表明，相比大多数细胞被感染，少数细胞被感染时，cccDNA的寿命可以延长两倍。当少数细胞被感染时，由于溶细胞免疫反应导致的细胞死亡较少，肝细胞增殖速率较低，cccDNA的损失减少。对于相应的少数细胞被感染且有丝分裂中无cccDNA存活（q=0）的HBeAgPOS感染，cccDNA的最大预期寿命是天(71-天；图2，绿线)。最近的HBV实验和建模结果表明，有丝分裂中存活下来的cccDNA分子相对较少，这使得更长的寿命成为合理的预期。
2.动力学的数学模型
为了证明模型的数据合理，作者提供了有丝分裂中无cccDNA存活的动力学例子。作者使用了与估算的cccDNA生成时间相兼容的参数(HBeAgPOS感染期间61天，HBeAgNEG感染期间26天)。由于肝细胞是长寿的，作者将自然死亡率定义为d=0.，为简便起见，作者假定溶细胞反应比非溶细胞反应具有更强的抗病*活性，因此作者设置c=0。假设中性突变率是μ=2×10??s/s/c。q=1时的模型动态与q=0时的情况相似，但在感染早期阶段的cccDNA的寿命预计在q=1时更高(见下文)。图1C给出了结果的图示，表2给出了参数的总结。
表2.用于描述模型动态的参数
3.HBeAgPOS感染
与前期报道一致，作者将cccDNA的复制能力b定为0.3/天，因此，肝脏中cccDNA分子的数量在感染约3个月后达到峰值。假设cccDNA的生成达到平衡时间为61天，在既定假设下，在感染的前几个月，cccDNA迅速增加，导致模型预测的病*产生时间较短，为3.3天（图3），与近期一项报道指出的新感染细胞产生病*颗粒的时间约为3天相一致。在感染早期，这种短的cccDNA扩增时间与长cccDNA寿命形成对比(图3，与q=1相比，q=0预测的寿命更长)。由于扩增时间较短，在感染的早期阶段中性进化率的预测值也很高。随着感染的进展，由于易感靶细胞减少，病*扩增时间增加反过来又降低了进化速率。在平衡状态下，病*的估计扩增时间和cccDNA的寿命是相同的，以上规律使作者能够依据中性进化率确定这些参数，而不依赖于模型的参数。由于受感染的肝细胞的寿命很长，模型中cccDNA载量较高。这与大多数肝细胞在感染高峰时被感染的观察结果一致。
图3.宿主内模型中cccDNA的种群和进化动态
4.HBeAgNEG感染
作者假设从HBeAgPOS到HBeAgNEG的转变发生在达到HBeAgPOS平衡之后的任意一段时间，并与cccDNA的扩增时间从61天减少到26天有关。假如这种减少的扩增时间没有伴随着复制能力的下降，那么cccDNA的载量只会有少量的下降(图3，第一行图蓝线)。然而，这与体内感染不一致，在体内感染中，cccDNA分子的数量和细胞外HBVDNA水平在过渡到HBeAgNEG感染后通常会下降几个数量级。所以，如果cccDNA载量较低，则通过扩增时间的倒数来估计复制能力。在26天的扩增时间内，每天产生0.个DNA，导致cccDNA在HBeAgNEG期间的复制能力为HBeAgPOS感染时的十分之一。在图3中，橙色线显示了在HBeAgNEG感染期间，当R0=1时模型的动态变化(即，δ=0./天和b=0./天)。在这种情况下，cccDNA载量以相对缓慢的速度下降。蓝线表示的是R0=0.7(δ=0./天)时的动态。然而，即使δ略有增加，cccDNA的数量预计也会迅速下降。
5.治疗时根除cccDNA的预计时间
当感染细胞较少时，若q=0，则推测HBeAgPOS感染过程中cccDNA的寿命为天。即使对cccDNA寿命有更长的估计，如果在治疗开始时有个cccDNA分子，作者通过公式预计在治疗不到10年后，cccDNA池就会耗尽(图4A)。此外，如果在HBeAgNEGCHB期间开始治疗，因其寿命为26天，且治疗开始时肝脏中cccDNA分子的数量较少(2×)，预计消除cccDNA的时间更快(只有1.5年)。然而，临床上经过多年治疗，仍有很高比例的人持续感染，且HBeAgNEG与HBeAgPOS治愈率无明显差异（实际上，HBeAgNEG的初治患者对治疗的病*学应答率可能更差）。这可能是因为上述预计的HBeAgNEG患者的cccDNA寿命过短有关。另一种解释为NAs治疗期间仍然存在cccDNA扩增（虽然扩增减少，但实际上很难完全阻止），或存在可长期存活的感染肝细胞亚群。为了评估这两种情况，作者在具有不同病*复制水平(图4B)或存在长期存活的肝细胞亚群(图4C)的NAs治疗下，对慢性乙型肝炎患者的cccDNA动力学进行了建模。通过建模分析得，cccDNA动力学对模型参数的改变更为敏感，使得其难以解释cccDNA清除治疗失败，但是存在对免疫杀伤不敏感的感染肝细胞群时，cccDNA清除时间受模型参数的影响更小，其变化更为稳健，随着长期存活肝细胞死亡率的增加，清除cccDNA的时间逐渐缩短但是变化较小。这使得长期存活的肝细胞亚群成为更为可能的解释。然而，由于治疗过程中cccDNA池动态可能是复杂的，且个体之间存在差异，临床上仍需结合多因素进行分析。
图4.模型预测的NAs治疗效果。b:cccDNA的复制能力;dr:长期存活肝细胞平均自然死亡率
总结
本研究根据突变率和宿主内进化率，提供了一个估计HBVcccDNA寿命的新模型，并据此预测HBeAg阳性CHB期间的cccDNA平均寿命为61天，而HBeAg阴性感染阶段仅为26天，与HBeAg阳性相比，HBeAg阴性阶段的复制能力明显降低，这些可能反映了HBeAg阴性阶段较强宿主的免疫反应。在NAs治疗下，长期存活的肝细胞可作为cccDNA池，延长了cccDNA的清除时间。作者对cccDNA持久性和扩增的估计提供了对CHB潜在机制的见解，可为治疗提供有用的信息。
文献来源：
LythgoeKA,LumleySF,PellisL,McKeatingJA,MatthewsPC.EstimatinghepatitisBviruscccDNApersistenceinchronicinfection.VirusEvol.;7(1):veaa.PublishedAug25.doi:10.3/ve/veaaPMID:PMCID:PMCDOI:10.3/ve/veaa
编译：许梓萌彭宇李桂馨
编辑：刘天旭
校对：许梓萌
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乙肝病*病原学及相关研究
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