摘要
乙型肝炎病*（HepatitisBVirus，HBV）是一种感染肝实质细胞并且导致严重肝脏疾病的病*，合并感染丁型肝炎病*（HepatitisDeltaVirus，HDV）时会显著加速疾病进展。尽管两种病*的基因组不同（HBV是松弛环状部分双链DNA，HDV是杆状RNA），但二者均是以游离基因的形式维持在被感染细胞的细胞核中，并通过宿主细胞机制对其RNA进行转录。本篇文章旨在对HDV复制周期进行知识更新，以便最终寻找可能存在的新型抗病*靶点。
HDV是一种卫星病*
70年代末，在对感染乙肝病*的极重症肝炎病人的研究过程中，一种小型病*被发现并命名为丁型肝炎病*。这种病*在后续的研究被证明是一种缺陷型卫星病*，它通过利用HBV的包膜从肝细胞释放并重新进入肝细胞内（图1）。除了这些步骤外，HDV的细胞内复制与HBV无关。在无HBV感染的条件下，实验方法感染的HuHep小鼠肝脏内至少可以在6周内检测到HDVRNA。与HBV相反，在转染含有HDV基因组的质粒启动感染周期后，HDV能在不同种类的组织/细胞内复制。此外，最近在鸟类、蛇类中发现了HDV样病*，在鱼类、两栖类和无脊椎动物中也发现了与嗜肝DNA病*无关的HDV样病*。这些数据表明，HDV可能利用其它病*帮助分泌。一系列体外实验结果也表明，HDV核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）也可以利用几种非HBV相关病*的包膜进行包装，如丙型肝炎病*、*病*、水疱病*（图2），引出了HDV也可被人类其它病*传播的问题。
图1HBV和HDV病*颗粒的示意图。左图，上为感染性HBV病*（大球型颗粒），下为非感染性HBV颗粒。右图为感染性HDV。
图2传统HDV和HDV样颗粒示意图。传统HDV颗粒利用HBV包膜从肝细胞释放；HDV也可能利用其他辅助病*的包膜，例如丙型肝炎病*（HepatitisCVirus，HCV）或登革病*（Denguevirus，DENV）。
病*颗粒中HDV基因组形式和细胞内复制中间体
除了HBV包膜（或潜在的其它病*包膜）外，HDV病*还含有一个RNP，由一个约1.7kb的呈现非分支的准双链构型的环形单负链RNA基因组（HDVgenome，HDV-G）和两种病*蛋白，S-HDAg和L-HDAg组成（图1）。更准确地说，HDVRNA形成了一种包含许多内部环和凸起的准dsRNA。它与HDAg的相互作用更多地取决于其二级结构而不是其一级序列。HDAg以多聚体（可能是八聚体）的形式与非分支的准双链HDVRNA片段结合形成核酸酶抵抗的复合物。S-HDAg和L-HDAg可以以同源多聚体或异源多聚体的结构形式存在，在循环的HDV病*中的S-HDAg和L-HDAg数量大致相同。
HDVRNA复制中间产物称为反式基因组（HDVanti-genomes，HDV-AG），仅存在于感染细胞的细胞核中，不在病*颗粒中。HDV-AG与HDV-G完全互补。HDVmRNA由HDV-GRNA转录产生，大小约0.8kb，是两种HDAg的翻译模板，S-HDAg由个氨基酸组成，L-HDAg在S-HDAg之后延续19个氨基酸，由个氨基酸组成，L-HDAg的mRNA由需要额外编辑的HDV-GRNA转录产生。尽管S-HDAg和L-HDAg有着几乎相同的序列，但它们在病*生命周期中具有各自独特的作用。S-HDAg是HDVmRNA转录和复制过程所必需的；L-HDAg是病*组装过程中不可缺少的。但低水平的L-HDAg会抑制HDV-GRNA的合成，当L-HDAg的量远超于S-HDAg时，则会抑制HDV-AG和HDVmRNA的合成（图3），可能是由于L-HDAg将与HDV-AG结合的S-HDAg多聚体破坏，进而干扰S-HDAg对HDV-GRNA合成的促进作用。
图3HDVRNA合成的示意图。
基因组复制和转录
HDV生命周期模式如图4所示。HDV病*通过使用HBV包膜蛋白以相同的机制进入细胞，即病*通过与肝细胞表面的钠离子-牛磺胆酸共转运多肽（Na?-taurocholatecotransportingpolypeptide，NTCP）和表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）共同作用，附着于硫酸肝素蛋白聚糖。一旦进入胞内，HDV核糖核蛋白就会转定位于细胞核，此过程可能与S-HDAg中存在核定位信号有关。在感染的细胞核内，HDV-G作为模板合成HDVmRNA，此过程中S-HDAg是启动转录的必要条件并且只需要少量的S-HDAg即可实现。因此HDV感染能够建立就说明，感染过程中进入细胞的RNP带来的S-HDAg足以启动转录，同时带来的L-HDAg数量不足以抑制HDVmRNA的合成。
HDV-G作为HDV-AG合成的模板通过滚环扩增方式进行复制，HDV-AG又成为滚环扩增的模板产生更多的HDV-G。在HDV-G和HDV-AG中均存在小的自裂解RNA序列，其作用是滚环扩增中产生的多聚RNA分子发生自裂解产生单倍的HDV-G/HDV-AG。在自裂解过程中，S-HDAg和L-HDAg均不是必需的，但二者可增强裂解作用。HDVRNA的环化连接机制尚不清楚，可能与核糖酶自连接活性或细胞因子有关。
图4HBV和HDV的生命周期示意图。
HDVmRNA合成的起始点可能不同于HDV-AGRNA合成的起始点，因为HDAg启动子区突变导致的HDV-AG积累的损失可以反式地被S-HDAg所逆转。现有很多证据支持，HDVmRNA合成的起始位点靠近HDV-GRNA杆末端区域，转录的起始位点取决于HDV-GRNA的二级结构而不是其一级序列。现已证明，Pol-II能识别HDV-G两极的末端茎环区，并与一般转录因子形成类似DNA启动子的预启动复合物。核旁斑的主要蛋白（PSF、p54nrb和PSP1）可能参与HDVRNA的积累，此过程中Pol-I样聚合酶可能参与调节。一方面，Pol-I的参与会导致转录本不被多聚腺苷酸化，这将解释为什么在滚环扩增合成HDV-AGRNA时多聚腺苷酸化信号保持沉默；另一方面，低浓度的鹅膏碱（Pol-II特异性抑制剂）和HDV-GRNA可以抑制HDV-AG的合成，且免疫沉淀Pol-II后能检测到HDV-AGRNA，表明HDV-GRNA的合成仍由Pol-II进行，并发生在PML复合体相关结构中。
现有证据表明，S-HDAg以八聚体形式与HDVRNA结合，能模拟组蛋白并招募细胞因子，促进HDVRNA合成（图5）。S-HDAg与连接体组蛋白H1e相互作用，若H1e突变缺失，HDV复制将会受到抑制。此外，S-HDAg还与Pol-II的不同亚基相互作用。不同翻译后修饰的S-HDAG，如磷酸化、乙酰化、甲基化等，对HDV-GRNA和HDVmRNA的合成有积极作用，但对HDV-AG的合成没有积极作用。例如，S-HDAg位丝氨酸磷酸化对于Pol-II的磷酸化活性很重要，而S-HDAg72位赖氨酸的乙酰化和12位精氨酸的甲基化对于S-HDAg的核定位以及HDV-GRNA、HDVmRNA的合成增强发挥重要作用。也有文献指出S-HDAg也与转录因子如YY1以及激活辅助因子如CBP、p、B23相互作用，共同促进Pol-II的招募。MOV10是一种RNA解螺旋酶，被证明与HDAg有相互作用，并与HDV-AGRNA的小帽结合进而促进HDVRNA的合成。最近在S-HDAg中发现了一个短的线性相互作用基序，允许S-HDAg与BAZ2B相关重塑因子（BAZ2B-associatedremodelingfactor，BRF）结合，在HDV感染人肝细胞中的BRF能与HDVRNP结合，这再次证明了S-HDAg对于招募转录起始的相关因子是必不可少的。除此之外还有许多蛋白参与了HDVRNA的合成，未来需要更多研究去全面了解其中的机制。S-HDAg除了可能参与转录因子的招募，还能通过去除抑制性因子来促进RNA的延长。尽管mRNA的转录和HDV-AG的合成都发生在HDV-G这一相同模板上，但它们需要HDAg不同的翻译后修饰来完成。最近也有人指出，在对HDV-AG的作用中，S-HDAg在转录后发挥的某些作用如稳定HDV-AGRNA或促进核酶活性，比直接作用于HDV-AG合成的作用更重要。
图5在启动HDVRNA合成中可能与S-HDAg和（或）HDVRNA相互作用的细胞因子示意图。S-HDAg以八聚体的形式与HDVRNA结合，并与组蛋白、Pol-II的不同亚基、转录因子、激活辅助因子、RNA解旋酶以及染色质重塑因子相互作用。
从HDVRNA编辑到病*颗粒的产生
如果S-HDAg是感染早期由HDVRNP传入的HDV-G转录产生的，那么L-HDAg则是由在HDV-AG上发生琥珀型终止密码子（UAG）编辑而最终使HDVmRNA终止密码子突变进而产生的。现已证明，腺苷脱氨酶ADAR1负责这种编辑（图3），究竟是干扰素诱导型（ADAR1-L）还是非诱导型（ADAR1-S）发挥该功能目前还存在争议。由于琥珀型位点的结构对于ADAR1的编辑和与HDAg的相互作用是次优的，这导致了L-HDAg的表达滞后。这种延迟表达使病*从复制到形态发生的整个生命周期得到调整。L-HDAg中额外的19个氨基酸包含一个核输出信号（nuclearexportsignal，NES）和一个异戊二烯化位点，这些位点是病*组装所必需的。细胞L-HDAgNES-交互蛋白（NES-interactingprotein，NESI）被证明在促进L-HDAg核输出过程中发挥重要作用。L-HDAg会与细胞输出受体TAP和适应蛋白Aly形成复合物，此复合物在HDV组装过程中必不可少。L-HDAg的异戊二烯化位点对与HBsAg的相互作用至关重要，HBsAg的氨基酸序列和数量将会影响HDV颗粒的组装、释放和感染性。新生成的HDVRNPs将会通过高尔基体网络进行转运，并由网格蛋白介导。
HDV对于宿主的影响
尽管现在缺乏标准的检测方法，但HDV/HBV联合感染与其他病*联合感染相比仍被认为是全球最流行的，至少有万人长期慢性感染HBV和HDV。HDV/HBV合并感染是最具侵袭性的慢性病*性肝炎。在HBV阳性的暴发性肝炎患者中，33%-39%的患者HDV检测阳性。慢性HDV/HBV感染者的主要并发症为肝纤维化/肝硬化，并会逐渐发展为肝功能失代偿乃至死亡。据评估，合并感染10年、20年和30年后，肝硬化的风险分别为23%、41%和77%，长期HDV/HBV合并感染的患者发生肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）的风险比HBV单一感染的患者至少高3倍。此外，在瑞典国家HIV队列研究中，HDV被认为是HIV患者的主要并发因素。
已经发现的8种HDV基因型（I-VIII）具有明显的地理分布。HDAg对HDVRNA复制的支持具有明显的基因型特异性，比如基因III型HDAg无法支持HDV基因I型的复制。根据现有少量临床相关研究，病*基因型对疾病进展有显著的影响。与HBV基因B型和HDV基因II、IV型相比，HBV基因C型和HDV基因I型分别与疾病低缓解率和严重进展相关。HBV基因型可能会影响HDV的感染，有报道称，患者合并感染HBV基因A型比合并感染HBV基因D或F型的HDV病*载量要低，HDV合并感染HBV基因F型的患者更为常见。需要注意的是，由于病*基因型的地理分布不同，不能排除环境因素对病*复制和疾病结果产生的影响。在体外和动物模型研究中，大多采用的是HBV基因D型和HDV基因I型，没有一项研究报告系统地对不同基因型病*进行比较。
在大多数合并感染HBV/HDV的病例以及在不同的动物模型中，均发现HDV抑制HBV的复制。最近有一项例HBV/HDV感染患者的横断面研究报告，结果显示75%的病例中HDV占优势，7%的病例中HBV占优势，其余病例无优势项。有趣的是，HDV优势与一些白细胞介素、趋化因子和细胞因子的下调有关，也与对聚乙二醇干扰素α（Pegylatedinterferonalpha，Peg-IFN-α）的治疗反应延迟有关。值得注意的是，对合并感染HBV/HDV患者纵向分析，随着时间推移，病*优势会表现出不同的特征，显示了两种病*与宿主之间相互作用的复杂性。目前，对于HDV如何干扰HBV的认识有限，可能涉及独立于适应性免疫系统的机制。利用过表达系统，有人认为两种HDAg可能通过抑制HBV增强子来抑制HBV复制。此外，在体外感染的非转化肝细胞和免疫功能正常的肝细胞中，当有HDV存在时，HBVRNA的水平下降，但cccDNA的水平没有下降，这表明HDV抑制了HBVRNA的转录或稳定性。值得注意的是，感染性HDV颗粒可以在HBV非复制细胞中产生，这些细胞通过整合的HBVDNA产生HBsAg，这表明尽管HBV复制受到抑制，慢性HDV感染可以持续存在，这就需要研发HDV感染的特异性治疗方法。
尽管HDV已经被证明能够通过MDA5激活IFN通路，但已有的实验和临床研究表明，HDV是一种较弱的固有免疫诱导物，并已进化出逃避固有免疫识别的机制。如有研究表明，HBV和HDV都可以抑制JAK/STAT信号通路从而抑制对外源性IFN的反应。两种病*与肝细胞先天免疫之间的相互作用对于疾病的发生仍需研究。尽管干扰素对于HBV、HDV、HIV等多种病*的抗病*作用已得到公认，但在慢性病*性疾病中干扰素途径的长期激活也可能会促进疾病进展。事实上，IFN-α对细胞免疫有抑制作用，其通过诱导产生免疫抑制性细胞因子如IL-10并上调抑制性受体的配体如PD-L1，这可能进一步导致HIV免疫的失控。在感染了HBV的病例中，可以观察到IFN-α治疗会增加NK细胞的数量，通过TRAIL依赖机制诱导杀伤HBV特异性CD8?T细胞。因此，HDV可能通过激活I型IFN通路促进这种机制，进而提升合并感染患者HBV的致病率。有报道指出，HDV蛋白能改变自噬过程进而促进其基因组复制，导致氧化应激并调控TGF-β和NF-κB信号通路。然而上述HDV和细胞之间的相互作用的研究大多是在人工过表达系统完成的，甚至有些使用的是非肝细胞系。大多数报道的HDV蛋白与细胞蛋白间的相互作用需要在感染系统中验证。通过RNAi功能抑制和小分子筛选技术，有学者在HDV感染的HuH7-NTCP中确定了缺氧诱导因子（hypoxia-induciblefactor，HiF）信号、胰岛素抵抗通路以及糖胺聚糖生物合成和嘧啶代谢是HDV复制的关键。此外，学者们还利用HDV原代人肝细胞确定了氨甲酰磷酸酯合成酶2、天冬氨酸氨基转移酶、二氢乳清酸酶和雌激素受体α是HDV生命周期中的关键宿主因子。
总结
大多数目前已知的HDV结构和生命周期的知识是90年代通过使用生化分析由体外实验提出的，鉴于当时没有感染体系，很少有数据是经过相关体系验证过的。关于HDV生命周期，及其与HBV和宿主的相互作用仍需要进一步的研究，这对于研发有效抗HDV的抗病*策略是必须的。
文献来源：
LuciforaJ,DelphinM.CurrentknowledgeonHepatitisDeltaVirusreplication.AntiviralRes.;:.doi:10./j.antiviral..
文字：孙盈哲邹*
编辑：顾智强
校对：毛天皓
片警实验室
乙肝病*病原学及相关研究
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